基因编辑是一种能改变生物体基因组序列的基因工程技术，主要通过人工核酸内切酶实现对基因组特定基因序列的敲除、插入或精确修饰。目前，基因编辑主要有三种方法：锌指核酸酶技术（ZFN）、转录激活效应因子核酸酶（TALEN）技术和CRISPR/Cas系统介导的基因编辑技术（可参考“CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用”一文）。

进行基因编辑时，人工核酸内切酶能够识别并切断靶DNA序列，产生DNA双链断裂（Double-strand break，DSB），然后细胞会进行及时修复，主要有两种修复途径：非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源重组（Homologous directed repair, HDR）。通过NHEJ修复DSB时，细胞常会在断裂位点插入或删除几个碱基(indel)，快速将DNA连接起来，因此导致的基因序列变化而使修复后的基因突变，功能丧失，称之为基因敲除（Knock out，KO）；通过HDR修复DSB时，细胞修复系统会将额外提供的一个与靶DNA两侧同源的外源片段作为模板，在DSB处合成与同源序列互补的基因序列，由于外源片段中携带待敲入的突变或目的基因，因此就可以在基因组中精确地引入点突变，或者插入目的基因，称之为基因敲入（Knock in，KI）。

基因敲除和基因敲入作为基因编辑工具的两大基本应用，为科研人员研究基因功能、了解遗传疾病、开发新的治疗方法提供了强而有力的帮助，此外，科研人员不断开发和完善基因操纵方法，以期未来在医疗、农业和生物技术方面带来重大突破。

图1 CRISPR/Cas9基因编辑机制（Yanxin X et al.,2022）。

一、基因敲除（KO）

基因敲除是指使生物体基因组中的特定基因失活或失效的过程。通常是通过在靶基因中引入突变来实现的，使其失去功能。进行基因敲除的方法，包括同源重组、RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9。同源重组即通过引入修饰的DNA片段，用无功能或被破坏的版本替换靶基因；RNAi利用小RNA分子来沉默或降解靶基因的信使RNA（mRNA），阻止其翻译为蛋白质；CRISPR/Cas9是一种革命性的基因编辑工具，它使用引导RNA（sgRNA）和Cas9酶在基因组的特定位置引入靶向DNA断裂，导致基因破坏。

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二、基因敲入（KI）

基因敲入是指将一个新的基因或DNA序列插入到基因组中的一个特定位置。可以通过同源重组、病毒载体或CRISPR/Cas9来实现。同源重组介导的基因敲入需要将一个包含所需基因序列的修饰DNA片段引入到目标位点；病毒载体，如逆转录病毒或腺相关病毒（AAVs），可以用来将新基因传递到基因组中；CRISPR/Cas9也可以通过使用供体DNA模板以及sgRNA和Cas9酶来插入一个基因。

三、基于CRISPR/Cas9的基因敲除（KO）

原理：当Cas9内切酶切割双链DNA时，细胞自身启动更具优势的NHEJ修复途径，导致切割位点产生移码突变或片段缺失，从而造成基因沉默，功能丧失，实现基因敲除。

图2 基于CRISPR/Cas9基因敲除的示意图（Petazzi P et al., 2020）。

步骤：

（1）分析敲除基因，确定敲除靶标位点；

（2）设计并合成识别靶标位点的sgRNA；

（3）构建基因敲除载体；

（4）构建基因敲除细胞株:依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式（脂质体、电转或病毒包装）；

（5）将抗生素素筛选后分离的细胞克隆进行测序验证；

（6）96孔板进一步筛选单克隆并测序，选择敲除纯合细胞株。

应用：基因敲除实验被广泛用于研究基因功能和了解特定基因在各种生物过程中的作用。通过观察基因失活的影响，研究人员可以推断出该基因的正常功能，确定其对疾病的贡献，并发现潜在的治疗靶点。具体如下：

（1）CRISPR/Cas9基因敲除细胞系的建立；

（2）CRISPR/Cas9基因敲除动物疾病模型的建立。

四、基于CRISPR/Cas9的基因敲入（KI）

原理：当Cas9内切酶切割双链DNA时，同时提供一段与靶基因高度同源的DNA修复模板，生物体即可启动HDR修复路径。这段模板可以是单链DNA（ssDNA），也可以是双链DNA（dsDNA)，上面包含一段目的序列，其两侧序列与切口附近的基因组序列一致，因此可以作为同源臂将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点，从而实现精确的基因敲入。

图3 基于CRISPR/Cas9基因敲入的示意图（Murillo-Rodríguez E et al., 2018）。

步骤：

（1）分析敲入基因，确定靶位点进行sgRNA的设计；

（2）构建敲入载体:Cas9-sgRNA表达质粒、donor DNA;

（3）构建基因敲入细胞株：依据所要编辑的细胞选择Cas9、sgRNA和donor不同导入方式（脂质体、电转或病毒包装）；

（4）将抗生素素筛选后分离的细胞克隆进行测序验证；

（5）96孔板进一步筛选单克隆并测序，选择敲入纯合细胞株。

应用：基因敲入技术可用于各种目的，除了在培养细胞中进行基因敲入外，还包括在动物模型中引入特定的遗传变异来研究其影响，补偿本地基因的丢失或故障，以及创造具有所需性状的转基因生物体。具体如下：

（1）CRISPR/Cas9基因片段敲入细胞系的建立；

（2）CRISPR/Cas9基因单碱基突变细胞系的建立；

（3）CRISPR/Cas9基因敲入动物疾病模型的建立。

参考文献

Murillo-Rodríguez E,Rocha B N,Veras B A, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J].Sleep and Vigilance, 2018,2(1).

Petazzi P ,Pablo Menéndez, Sevilla A .CRISPR/Cas9–Mediated Gene Knockout and Knockin Human iPSCs[J].Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2020.

Yanxin X,Chen C,Yaxin G, et al. Effect of CRISPR/Cas9-Edited PD-1/PD-L1 on Tumor Immunity and Immunotherapy[J].Frontiers in Immunology, 2022,13.